ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МАГНИТНОЙ СЕПАРАЦИИ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА ИЗ КЛИНИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ

И.И. Кузьмин, И.Ф. Ахтямов, Р.И. Кузьмин

Казанский государственный медицинский университет, Приморская краевая клиническая больница, Владивосток, Россия.

Способ выделения генетического материала имеет решающее значение для успеха клинического применения методов молекулярной диагностики.

Используемые в молекулярной генодиагностике амплификационные методы, наиболее распространенньми среди которых является полимеразная цепная реакция (ПЦР), обладают достаточной чувствительностью для определения единичных копий исследуемого гена.

Главная проблема, возникающая при внедрении этих методов, в клиническую практику заключается в необходимости выделения исследуемого генетического материала из самых разнообразных биологических субстратов.

Наибольшую сложность представляет ингибирование амплификационных реакций различными компонентами, содержащимися в биосубстратах. Наличие ингибиторного эффекта сильно снижает чувствительность реакции или делает ее успешное проведение вообще невозможными. Проблема ингибиторного эффекта особенно трудна для решения в клинической практике, поскольку ингибиторами могут быть самые различные вещества. Точная природа и механизм ингибиторного эффекта неизвестны, и проведение таких исследований сильно затруднено вследствие неспецифичности взаимодействий лежащих в его основе. В целом можно определить ингибиторный эффект как влияние различных компонентов реакционной смеси на активность полимеразных ферментов. Ингибиторное действие могут оказывать самые различные компоненты, встречающиеся в биосубстратах и неспецифически связывающиеся с полимеразой, блокирующие ее активность. Это главным образом сложные высокомолекулярные комплексы, состоящие как из биополимеров, составляющих компоненты межклеточного матрикса и многих биологических субстратов, таких как мокрота и синовиальная жидкость, так и комплексы денатурированных белков. Ингибиторный эффект особенно неблагоприятен своей непредсказуемостью, поскольку сильно зависит от состава конкретного субстрата. Поэтому единственным направлением для успешного внедрения методов молекулярной генодиагностики в клиническую практику является применение такого способа выделения изучаемого генетического материала из исследуемого субстрата, который позволил бы осуществлять селективное извлечение необходимой нуклеотидной последовательности и полное удаление всех других компонентов, включая все возможные ингибиторы.

Наиболее эффективным на сегодняшний день является метод магнитной сепарации. Он осуществляется следующим образом: к субстрату после его денатурации, проводящей к высвобождению в раствор генетического материала, добавляется небольшое количество олигонуклеотидов, комплементарных исследуемым последовательностям. Наиболее целесообразно использовать для этой цели один из каждой пары праймеров. К 5' концу этих олигонуклеотидов присоединен биотин. После денатурации исследуемого генетического материала, разрушающего его вторичную структуру, добавленные олигонуклеотиды специфически гибридизируются с комплементарными им участками исследуемых последовательностей. Эффективность гибридизации обеспечивается большим избытком олигонуклеотидов по отношению к выделяемой последовательности и проведением реакции в жидкой фазе. К полученному раствору добавляются магнитные микросферы, покрытые стрептавидином, прочно и специфично связывающим биотинилированные олигонуклеотиды с присоединяющимися к ним изучаемыми последовательностями. Микросферы после этого осаждаются из раствора под действием магнитного поля создаваемого мощньми магнитами, вмонтированными в специальные штативы. Такие иммобилизованные микросферы тщательно промываются, что обеспечивает полное удаление всех не связавшихся с микросферами компонентов, включая любые возможные ингибиторы. Обнаруживаемая последовательность при этом остается прочно связанной с микросферами. Микросферы вместе с иммобилизованными на них изучаемыми последовательностями непосредственно вносятся в реакционную систему для ПЦР, поскольку они не оказывают ингибиторного эффекта. Таким образом, метод магнитной сепарации позволяет осуществлять специфическое извлечение исследуемых последовательностей из большого (до 1 мл) объема любого клинического материала. Использование этого метода позволит внедрить методы молекулярной генодиагностики в широкую клиническую практику.